制作食用菌一级菌种培养基的方法和步骤
一、任务目的
·了解食用菌母种培养基制作原理和配方。
·学会母种培养基的制作技术。
·熟悉高压蒸汽灭菌锅的构造及灭菌原理，正确掌握高压蒸汽灭菌锅的使用方法。
二、任务原理
培养基是人工配制的适合食用菌菌种生长的营养基质。为了获得优良和生长旺盛的母种，母种培养基的成分应选用营养丰富、容易被菌丝吸收利用的原料来进行配制。配制母种培养基时，一般应具备以下四个原则：第一，母种的菌丝比较嫩弱，分解养分能力差，因此要求营养丰富、完全，氮源和维生素的比例要高，需选用容易被菌丝吸收利用的物质，如葡萄糖、蔗糖、马铃薯、玉米粉、麦芽汁、酵母膏、蛋白胨、无机盐类和生长素等为原料；第二，注意各种成分的浓度配比要合适；第三，具有一定的生长环境，包括适宜的pH，多数食用菌喜偏酸性环境，pH5.0～6.5和渗透压等；第四，必须经过严格的灭菌，使之保持无菌状态。
三、材料与仪器
手提式高压灭菌锅、玻璃漏斗、漏斗架、弹簧夹、铝锅、电炉、1000mL量杯、纱布、棉花、18mm×180mm试管、细线绳、防潮纸或牛皮纸、刀、马铃薯、葡萄糖或蔗糖、琼脂、pH试纸、1mol/L NaOH溶液、1mol/L HCl溶液。
四、任务实施
1.母种试管斜面培养基的制作
（1）常用配方
①马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）：马铃薯（去皮）200g，葡萄糖20g，琼脂18～20g，水1000mL，pH自然。
②马铃薯综合培养基：马铃薯（去皮）200g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，维生素B110mg，琼脂18～20g，水1000mL，pH自然。
上述两种培养基适用于培养绝大多数食用菌母种。
（2）工艺流程：材料选择→准确称量→萃取→配制定量→分装→灭菌→斜面摆放→无菌检查。
材料的选择：组成食用菌母种培养基的材料中，有些材料浓度、成分都相对稳定，如葡萄糖、磷酸二氢钾等，有些天然营养材料就没有那么稳定了，往往由于对这些材料的选择直接影响培养基使用效果，影响食用菌菌丝的生长。如马铃薯、麦麸选择不好时，制成培养基后，食用菌菌丝就不能很好地生长。因此，要认真选择，选材时要注意：一是发芽的马铃薯不能用，因为芽眼处有大量的龙葵碱，对菌丝生长有毒害作用；二是表皮颜色变绿的马铃薯不能用；三是麦麸、米糠、豆粉、玉米粉等农产品发霉、发过霉，生虫或生过虫的不能使用。总之，要使用新鲜洁净的材料。
准确称量：各种食用菌菌丝的生长都要求具有一定的养分浓度，因此，使用配方的各种养分配比不可随意更改，称取时要准确。
（3）制备原则
①凡植物性材料均先单独煮沸萃取（两种或两种以上时可混合煮沸萃取），煮沸萃取时间为30min，煮沸30min后，取其上清液或滤液。如麦麸、米、糠、木屑、棉籽壳、稻草、堆肥、马铃薯等。
②生物制剂如酵母粉、蛋白胨，需事先用冷水溶化，然后加入。
③化学试剂最后加入，凡属化学试剂类营养物质，如葡萄糖、麦芽糖、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁等，均在配制的最后一步加入，并不断搅拌以使其快速溶解，不可与植物性材料一起煮沸。
④以1000mL为配制单位的各培养基配方所列材料的用量均以最终配制成1000mL为单位，即1000mL培养基中的含量。因此，当某种培养基中加入较大量的某种汁液或某种浸提液时，要注意计算培养基的最终容量。当水煮萃取过程中使培养基水量不足时，可中途加水或最后补足水至1000mL。
（4）制作方法
①先将马铃薯洗净，去皮，挖掉芽眼，称取200g，切成1cm3的小块或薄片。
②将切好的马铃薯块放入铝锅内或大烧杯中，加水1000mL，放在电炉上煮沸后维持30min，至马铃薯熟而不烂。
③用4层湿纱布（纱布需浸水后拧干）过滤，去掉滤渣，由于马铃薯在煮沸过程中，有部分水被蒸发掉，所以过滤后的马铃薯汁，应加水补足水分至1000mL。
④将称好的琼脂加入马铃薯汁中，在电炉上用文火煮，直至琼脂完全融化为止（边煮边搅拌）。最后加入葡萄糖等可溶性物质搅匀。
⑤调节pH。培养基中的酸碱度（即pH）是影响菌丝生长的重要因素，因此培养基配好后应根据菌种对pH的要求进行调节。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基配好后，pH一般为中性，所以不必调节。如培养基低于所要求的pH时，应向培养基中滴加1mol/L的NaOH溶液；若培养基高于所要求的pH，应滴加1mol/L的HCl溶液进行调节。边滴入，边搅拌，边用精密pH试纸或pH计测定，直至合适为止。应该注意的是培养基的酸碱度在灭菌前不宜调至pH 6.0以下，否则灭菌后培养基不凝固。有些菇类的培养基要求在pH 6.0以下的，要待灭菌后在无菌条件下滴加盐酸或乳酸等进行调节。
⑥补水至1000mL。
⑦分装试管。培养基配好后应趁热用分装漏斗进行分装试管，装入试管高度的1/5，分装时应注意不得使培养基沾到试管口上，以防污染杂菌。母种培养基一般实验室采用18mm×180mm规格，而生产上采用20mm×200mm规格或20mm×250mm规格的试管。试管直径越大、试管越长，装入的培养基就越多，斜面长，菌种生长时间长，生产周期长，菌种越容易老化，但是成本低；而试管直径越小、试管越短，装入的培养基就越少，斜面短，菌种生长时间短，生产周期短，菌种不易老化，但是成本高，所以实验室采用小试管，而生产上采用大试管。
1—分装；2—塞棉塞；3—打捆；4—灭菌；5—摆斜面；6—接种
⑧塞棉塞。培养基分装完以后应立即塞上大小合适的棉塞或透气的胶塞。棉塞或胶塞应塞入试管内2/3，外留1/3。塞试管的棉塞时不能塞得过紧或过松，过紧不透气，菌种长不好，过松易脱落，也易污染杂菌。因此棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物进入培养基，防止由此而引起的污染；另一方面保证有良好的通气性能，使培养在里面的微生物能够从外界源源不断地获得新鲜无菌空气。因此棉塞质量的好坏对实验的结果有着很大的影响。一只好的棉塞外形应像一只蘑菇，大小、松紧都应适当。
⑨捆扎试管。将塞好棉塞的试管7支或9支扎成一把，在棉塞外面包一层防潮纸或牛皮纸，再用线绳扎紧，防止灭菌时棉塞被冷凝水浸湿。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。
⑩灭菌。培养基分装完后应立即灭菌。根据培养基的成分选择灭菌的压强和时间，如培养基成分中有高温下容易破坏的物质时，可采用0.5kg/cm2或0.8kg/cm2的压强，一般马铃薯葡萄糖琼脂培养基具体灭菌要求，采用1.05～1.1kg/cm2的压强，灭菌20～30min。母种培养基分装后必须马上进行高压灭菌，不可以过夜。因为母种培养基营养成分全面，其中速效性养分如葡萄糖和蛋白胨等，在制作过程中由于暴露在空气中，空气中的杂菌，尤其是细菌，落到培养基上会利用培养基的营养成分，在自然温度（20℃以上）下，12h以上就会萌发、生长，造成母种培养基污染杂菌，所以母种培养基分装后必须马上进行高压灭菌，不可过夜。
将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅夹套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中排尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，获得高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。摆斜面：试管取出后一定要趁热摆斜面，将试管斜放在一根2cm左右厚的木条上，使试管内的培养基成一斜面，斜面的长度一般为试管长度的1/2。用于保藏菌种的试管斜面应适当短些，以减少蒸发面积。气温较低时，在摆好的斜面上覆盖一条厚毛巾，以免在试管壁上产生大量水珠，影响接种和培养。当培养基冷凝后，即可收起备用。灭菌效果的检查：将灭菌的母种培养基放入37℃的温室中培养24～48h，检查灭菌是否彻底，无微生物长出的为灭菌合格，即可使用。
2.制备母种培养基过程中的注意事项
①在加热熔解以及煮沸过程中，要边煮边搅拌，防止马铃薯等物质糊在容器底部。
②分装时，要注意流出的培养基不可沾在近试管口的内壁上，以防日后生霉，一旦管口内沾有培养基，待凝固后用接种钩取出，并用潮湿洁净的纱布擦拭干净再灭菌。
③各环节紧密衔接，特别是分装后要立即灭菌，不可隔夜。
④灭菌时放汽要充分，否则影响灭菌效果。
3.平板培养基的制作
平板培养基常用于单孢子分离，测定菌丝生长速度，观察菌落的形态，测定接种空间杂菌数。其制作方法如下：
①将培养皿洗净、干燥，使各培养皿盖方向一致，用牛皮纸包好，或放入特制铁罐内，注明皿盖的方向。高压灭菌或干燥灭菌后备用；
②取刚灭菌后尚未凝固的培养基置于无菌箱或超净工作台内，略打开灭菌过的培养皿盖（露一小缝），倒入培养基（厚度为0.5cm），封盖、冷凝，倒置备用。
五、实验报告
（1）结果分析 检查培养基灭菌是否彻底。如果导致灭菌后培养基长有杂菌，分析原因有哪些？该怎样处理？
（2）问题讨论 观察结果并对出现的问题进行分析、讨论。
六、思考与作业
（1）总结培养基制作过程需要注意的几个关键环节。
（2）试述母种培养基的制作过程。
（3）怎样正确使用高压蒸汽灭菌锅对培养基进行灭菌。
