一级菌种培养基的灭菌方法 注意什么

按上述制作过程培养基装好后就要立即进行灭菌；将其中的杂菌杀死，然后才能接入我们所需要的纯菌种，进行培养。一般都采用热力灭菌法。培养基的灭菌效果要经常检验是否灭菌彻底：一般情况下，灭菌后的培养基最好放在要培养的温度下，空白培养1周，可检查灭菌效果。如果在这一段时间内培养基没发生任何变化，说明灭菌效果良好，可以使用。具体操作如下。

（1）灭菌设备：手提式高压灭菌锅。

（2）具体灭菌要求:1.05kg/cm2，121℃，保持20～30min。

（3）操作过程：高压灭菌设备主要是指高压蒸汽灭菌锅，有立式、卧式和手提式等多种。不同规格和型号的高压灭菌器使用方法不同，使用前要详细阅读使用说明书，严格遵守操作规程。下面以手提式高压蒸汽灭菌锅为例简要介绍具体操作过程：

加水→装锅→盖盖儿→加热→当压力升为0.5kg/cm2时排放冷空气→正式升压→保压（1.05kg/cm2，121℃，保持20～30min）→停止加热→自然降压至零→排放余汽→开盖儿→取出灭菌物品→趁热摆斜面→检验灭菌效果（37℃空白培养48h）。

（4）使用高压蒸汽灭菌时，应注意以下事项：

①灭菌锅内的冷气必须排尽。冷空气的热膨胀系数大，若无菌锅内留有冷空气，当灭菌锅密闭加热时，冷空气受热很快膨胀，使压力上升，造成灭菌锅内压力与温度不一致，产生假性蒸汽压，锅内温度低于蒸汽压表示的相应的温度，致使灭菌不能彻底。特别是使用只装有压力表，没有温度表的灭菌锅时，尤应注意。

排除冷空气的方法有两种：缓慢排气和集中排气。缓慢排气法，即开始加热灭菌时便打开排气阀门，随灭菌锅内温度逐渐上升，锅内的冷空气便逐渐排出，当锅内温度上升到100℃，大量蒸汽从排气阀中排出时，即可关闭排气阀，进行升压灭菌；集中排气法，即在开始加热灭菌时，先关闭排气阀，当压力升到0.5kg/cm2左右时，打开排气阀，集中排出空气，让压力降到零，并有大量蒸汽排出时，再关闭排气阀进行升压灭菌。固体培养基灭菌时可采用集中排气法，液体培养基灭菌时一般不宜采用，以免液体冲出瓶口。

②灭菌锅内的培养基必须排列疏松，使蒸汽畅通。灭菌锅内蒸汽是否畅通，关系到灭菌温度是否均一。灭菌材料若放得过多、过密，会妨碍蒸汽的流通，影响温度分布的均一，造成局部区域温度较低，甚至形成温度“死角”，达不到彻底灭菌，常常导致杂菌污染。

③灭菌完毕，应缓慢减压。高压蒸汽灭菌结束后的排汽降压不能太快，若排汽太快，瓶内外的压力差就会增大，引起瓶塞冲出瓶口；液体培养基灭菌时，液体会突然沸腾，弄脏瓶塞；塑料袋装培养料灭菌时，应让其自然冷却，当压力下降到0.5kg/cm2左右时，再打开排气阀放气，以免在减压过程中，袋内外产生压力差，把塑料袋击穿，导致以后杂菌污染。压力表指针未降到“0”时，决不能打开锅，以免锅内物品喷出伤人。

④注意棉塞防湿。用棉塞塞的瓶子或试管，在高压蒸汽灭菌锅中灭菌时，因锅中热蒸汽在锅壁四周和锅盖内侧容易产生凝结水，凝结水沿着锅壁和锅盖流下，弄湿棉塞。潮湿的棉塞在培养过程中，容易生长链孢霉等霉菌，污染培养物。为了防止棉塞潮湿，灭菌时，瓶子的棉塞不能接触灭菌锅壁，瓶子上面要盖铝帽或防水油纸，以免锅盖下面的水流到棉塞上。灭菌结束时，应先排放锅内热水，然后再慢慢排放蒸汽降压。若棉塞潮湿，可在锅中烘烤一定时间再取出来。