二三级菌种消毒和接种的方法步骤
①高压蒸汽灭菌 作用时间、作用温度及饱和蒸汽三大要素是该法灭菌的基本要素。高压蒸汽灭菌锅压力的保持时间与被灭菌的物料有关，斜面试管培养基灭菌时在121℃的温度下，经30min即可达到灭菌目的。制作原种或栽培种使用的棉籽壳、木屑、麦粒等固体培养基材料，热力不易穿透，在0.147mPa的压力下，即温度为126℃，需保持2h左右，才可达到灭菌的目的。操作步骤及注意事项与手提式高压灭菌锅相同。
②常压蒸汽灭菌 利用自然压力下，水沸腾产生的100℃蒸汽温度进行灭菌的方法，称为常压蒸汽灭菌。该灭菌法特别适用于大规模塑料袋菌种或熟料栽培筒的灭菌。生产上多采用自制的常压灭菌灶，其建造方法根据各地习惯而异。其优点是灭菌设备可自行建造，结构简单，容量大，成本低。缺点是灭菌时间长，耗能多，操作稍有失误就会造成灭菌不彻底的情况发生。
③灭菌效果检验 随机取几瓶（袋）置于25～30℃温度下空白培养4～6d，一般会出现以下三种情况。
全部感染：说明灭菌不彻底，灭菌方法（时间、温度、压力）不对。
少数感染：可能是摆放过紧，蒸汽不流通；也可能是瓶、袋破裂，口未封好。
全部没有杂菌：说明灭菌彻底。
6.二、三级菌种的接种
所谓接种就是在无菌条件下，将母种或原种移接到适于其生长繁殖的经过灭菌的培养基上的过程。接种也是食用菌制种工作中一项最基本的操作，无论是菌种的移植、分离、鉴定还是食用菌的形态、生理等方面的研究都必须进行接种。接种的关键在于严格的无菌操作，操作不慎就会染上杂菌，导致失败，甚至使来之不易的优良菌种丧失。
为达到接种目的，操作人员必须树立严格的无菌观念，与接种有关的器皿、工具和培养基，必须处于严格的无菌状态，不得带有任何活着的微生物，以免在操作过程中造成污染。为此，必须做到：①对培养基和接种工具进行严格的灭菌；②对操作环境进行彻底的消毒；③操作者的手要用酒精棉球进行消毒；④严格遵守无菌操作规程。即使做到了以上几点，整个操作区域仍难免有杂菌存在。因此，操作者必须小心细致。
（1）无菌操作要求
接种时的无菌操作有：斜面移接斜面，斜面移接菌种瓶，菌种瓶移接栽培袋等。尽管接种内容和形式不同，在操作上有一定的差异，但基本程序，特别是无菌要求是一致的。无菌操作的要求有以下几点：
①接种空间一定要彻底灭菌。
②经烧灼灭菌的工具，须贴在管（或瓶）的内壁冷却后再取菌种，所取菌种也不得在火焰旁停留，以免灼伤菌种。
③菌种所暴露或通过的空间必须是无菌区。
④菌种与容器外空间的通道口须用酒精灯火焰灭菌。
⑤各种工具与菌种接触前都应经火焰烧灼灭菌。
⑥棉塞塞入管口或瓶口的部分，拔出后不得与未灭菌的物体接触。
⑦每次操作时间要尽量缩短，避免因室内空气交换而增加杂菌。
接种方法
①菌种的选择与处理。食用菌母种质量一定要典型、纯正和茁壮，否则就应该淘汰。首先要求食用菌母种具有本品种的典型特征，如平菇有气生菌丝，黑木耳会产生色素等；其次是菌丝茁壮，均匀一致；最后是要求菌种不能带有除食用菌本身以外的其他微生物，也就是各种杂菌，包括细菌、霉菌、放线菌、病毒等，一般细菌污染会产生斑点状的菌脓，放线菌与细菌症状类似，而霉菌会产生各种颜色的斑点或拮抗线等，病毒没有明显的表现症状。
接种前要检查供接种用的母种或原种的纯度和生活力，检查菌种内或棉塞上有无霉菌斑和细菌菌落，原种瓶内有无因杂菌侵入所形成的拮抗线。有明显的杂菌污染或者对菌种纯度有怀疑的、母种培养基开始干缩的、原种培养瓶上出现大量灰褐色分泌物的、培养基内菌丝长势不好、菌丝稀疏或多是细线状菌索的、没有菌种标签的可疑菌种，均不能用于接种。
在冰箱中保存的母种使用时要提前取出，活化1～2d再用；若母种在冰箱中保藏的时间较长，超过3个月，最好转管培养一次再用，以提高菌种生活力，保证接种成功。
②母种接原种方法。母种接原种（原种接种）就是将试管菌种接入原种培养基的过程，必须在接种室或接种箱内进行。少量原种可利用超净化工作台或接种箱。接种的无菌操作规程和母种转管的无菌操作基本相同。具体操作方法是：用接种铲除去母种前端1cm左右部分和老菌种块，然后将斜面横向切割成5～8段，将每段连同培养基一同挑出并接入瓶内接种穴处。若两人配合接种更方便。1支母种可扩接5～8瓶原种。
大量原种接种往往利用塑料接种帐或接种室，按照无菌操作规程，3个人配合进行接种。具体操作是：在酒精灯火焰附近，1人负责铲取菌种，1人负责打开袋（瓶）口，2人配合将菌种接入，打口的人同时负责迅速封口；第3个人负责搬动待接的原种菌种瓶（袋）及喷消毒药等工作。3人配合动作要迅速，每1次接种的时间夏季以1h左右为宜，冬季可以适当延长。
③原种接栽培种方法。原种接栽培种（栽培种接种）就是把原种接入栽培种培养料的过程。栽培种接种也要按照无菌操作的要求，在塑料接种帐或接种室进行。接种前将选好的原种瓶，用75%的酒精棉球擦拭外壁，并对瓶盖或瓶塞进行消毒处理，以防开盖时杂菌落入瓶内，然后在酒精灯火焰上方拔出原种瓶棉塞或揭开封口膜，用火焰封锁瓶口，同时将接种勺用酒精灯火焰灭菌数次，用接种勺刮去瓶内菌种表面的老菌皮，再将菌种挖松并稍加搅拌，注意菌种应挖成花生米大小，不宜过碎，然后接种，接种方法与原种相似。罐头瓶栽培种接种一般3个人配合。如果采用塑料袋做容器，则接种时采取4人配合，1人负责挖取菌种，1人负责把持袋口，另外2人负责打开袋口和封口。1瓶原种一般可接30～60瓶（袋）栽培种。如原种充足，可适当加大接种量，这样菌丝蔓延快，培养时间可相应缩短。
