一级菌种的接种方法和注意事项

一级菌种的扩大培养是在试管间进行的，因此又叫转管，也就是通常所说的母种的接种。接种是非常重要的一个环节，同时也是一项技术性很强的工作，需要在无菌的环境中以无菌操作方法完成。如果将试管中的菌种从试管斜面移接到灭菌试管斜面培养基上，称为转管。转管原因：从外地购进或用分离法获得的母种经纯化后数量有限，不能满足生产需要时，要对初次获得的母种进行扩大繁殖，以增加母种数量。转管数量：一支母种可转接15～20支再生母种即生产性母种，扩大的数量根据实际情况而定。母种的扩大繁殖不可无限制地移代，移代过多菌种生活力减弱，从而影响大面积栽培的生产效益。转管次数不能超过三次，这是保证母种质量、防止菌种退化的关键。应根据菌丝体生长发育所必需的生长条件来选择培养基培养一级菌种，并进行扩大培养。

接种是将接种物移至培养基上，在菌种生产工艺中称为接种，而在栽培工艺即生产中称为下种或播种，它是食用菌菌种制作过程中的一个关键操作环节，接种操作方法是否得当直接影响着后续食用菌的生产成败。接种一般要在无菌操作下进行。

1.一级菌种的接种

1）接种方法

（1）接种物品准备　将试管母种（用报纸包好，避免紫外线照射）、空白斜面培养基、酒精灯、火柴、75%的酒精棉球、口取纸、记号笔、接种用具等先放入接种箱中或超净工作台上。

（2）接种设备预处理　接种前将接种箱用气雾消毒剂熏蒸30min；超净工作台在接种操作前30min开启紫外线灯（在进入操作前10min应先关掉紫外线灯），20min前开启风机，以保证在无菌条件下进行严格的无菌操作。

（3）接种前的消毒灭菌

①将手用75%的酒精棉球擦拭后伸入接种箱或超净工作台，再擦菌种试管外壁和接种工具，进行表面消毒后，点燃酒精灯，使火焰周围的空间成为无菌区，接种操作在火焰旁进行，避免杂菌污染。

②右手拿接种钩，在火焰上将接种钩顶端烧红灭菌，凡在接种过程中可能进入试管的部分，全部用火灼烧。

（4）移接菌种

①先将棉塞用右手拧转松动，以便接种时顺利拔出。

②将母种和空白斜面培养基用大拇指和其他四指握在左手中，斜面向上，并使它们与桌面接近水平，试管口略向下倾斜。

③用右手无名指和小指分别拔掉两个试管的棉塞，夹在手指间。

④以火焰烧灼管口，烧灼时应不断转动试管口（靠手腕动作），以杀灭试管口可能沾染上的杂菌。

⑤将烧灼过的接种钩伸入母种试管内，停留片刻让其冷却，以免烫伤菌丝。然后，轻轻挑取菌丝少许，迅速将接种钩抽出试管（注意不要使接种钩碰到管壁），移接到空白斜面培养基中央，气生菌丝朝上。注意不要把培养基划破，也不要使菌种沾在管壁上，抽出接种钩，烧灼管口，棉塞燎烤至微焦，在火焰旁塞上棉塞。再换接另一支空白斜面培养基。重复上述操作，直至原始种用完。一般1支试管母种可转接15～20支试管。

2）接种操作注意事项

①酒精灯火焰要高，酒精灯火焰不够高时，火焰周围的无菌范围小，不利于无菌操作，也易造成接种钩灼烧灭菌不彻底，影响接种后的成品率。影响火焰大小的因素一是酒精浓度，二是灯芯，酒精浓度越高燃烧越好，最好使用95%的工业酒精。灯芯材料太实，塞得又紧时，内吸的酒精少，火力也不旺。所以，灯芯最好用棉花捻制，并拨出一定的长度。

②母种试管表面和管口要灭菌彻底，作为接种物的母种试管表面并未处于无菌环境下保存。因此，接种时要注意试管表面和管口的灭菌。具体方法是：拔下棉塞后，在酒精灯火焰上转动2～3圈，这样可有效地减少菌种造成的污染。

③拔塞、取种、接种及塞棉塞必须在火焰上方或附近操作，母种试管和待接种的试管一旦打开棉塞，就不能离开火焰，因为只有在火焰周围很小范围内才是绝对无菌的。

④接种钩要灼烧彻底，接种钩最好用较薄的材料制成，灼烧时烧至红色。并注意接种钩灼烧的长度，灼烧长度以试管长度为度，在火焰上方反复灼烧3～4次即可。

⑤接种时掉到地上的棉塞不能使用，接种时棉塞要夹于右手指间，不可放在操作台上。一旦掉到台面上，塞之前要在火焰上过一遍再用。掉到地上的棉塞严禁使用。

⑥接种钩火焰灭菌后要冷却，不经冷却的接种钩会烫死菌种。冷却一般在无菌的待接种的试管上部空间进行，也可在斜面上端冷却。

⑦消毒酒精要清洁，注意定期更换。

⑧操作要到位，动作轻盈、敏捷、快速、准确，尽可能地减小声音。

⑨接种操作后的工作，及时清理，打开门窗，排除接种时酒精燃烧放出的废气。之后，关好门窗，打开紫外线灯进行使用后的消毒，以便以后使用。

⑩切取菌种时，注意母种斜面上方较干，要去掉干皮，母种块周围的菌丝也较老，最好不要使用。